Rekayasa Genetika (Kloning)

Alasan beralih ke rekayasa genetika

• Pemindahan gen merupakan prospek yang bagus
• Mengurangi biaya
• Meningkatkan hasil :

1. Bidang pengobatan
2. Hasil pertanian
3. Industri

• Penyediaan zat-zat tertentu yang secara alamiah terbatas

Rekayasa genetika : prinsipnya menyisipkan informasi genetik baru kedalam organisme (bakteri) untuk memberi kemampuan baru.

4 tahap rekayasa genetika
1. Memperoleh gen yang menyandi produk yang dibuat oleh pabrik mikroba
2. Menyisipkan gen kedalam mikroba
3. Menginduksi mikroba untuk mulai melakukan sintesis produk asing
4. Mengumpulkan produk yang dihasilkan mikroba tersebut

Pertama-tama temukanlah gen anda
Mengidentifikasi dan mengisolasi gen manusia yang menyandi pembuat protein
Gen diekspresikan untuk mengkonstruksi molekul mRNA pembuat protein
mRNA dapat diekstrak dari sel
mRNA mengandung informasi genetik yang diperlukan untuk membuat protein
Informasi genetik dari mRNA dirobah dalam bentuk DNA (transkrip balik)
Pencampuran transkrip dengan mRNA manusia dan molekul penyusun DNA menghasilkan salinan DNA disebut DNA komplementer (cDNA) krn berisi salinan instruksi genetik
Sel dipecah menghasilkan berbagai mRNA
mRNA tunggal dipisahkan dan ditambah enzim transkriptase balik bersamaan dengan nukleotida penyusun DNA
Terbentuk untaian mRNA sebagai untaian DNA yang disintesis
DNA yang bersintesis dirobah dari bentuk untaian tunggal menjadi heliks beruntai ganda dg bantuan enzim (DNA polimerase)
cDNA mempunyai informasi genetik yang sama dengan mRNA (salinan gen manusia)

Peranan plasmid
Plasmid adalah lingkaran DNA yang berukuran lebih kecil terdapat dalam beberapa bakteri
Plasmid membawa gen yang menyebabkan bakteri tahan terhadap antibiotika
Plasmid dapat keluar dari satu sel dan masuk ke sel lain, bahkan ke sel spesies lain
Apabila gen manusia dilekatkan ke cincin plasmid yang dibuka, maka plasmid akan memasuki bakteri dengan membawa gen manusia (vektor)
Untuk melekatkan gen manusia kedalam plasmid diperlukan enzim restriksi:
* membedakan struktur-struktur yang sama menunjukan kesempurnaan
* memotong untaian DNA dengan memilih pasangan yang spesifik

RESTRICTION ENDONUKLEASE DAN DASAR REKAYASA GENETIKA
Endonuklease restriksi memotong DNA pada sisi spesifik.
Dasar rekayasa genetika adalah memotong DNA target dan vektor pembawa/plasmid dengan endonuklease restriksi pada sisi spesifik, menyambung dengan DNA ligase dan transformasi ke dalam bakteri inang yang cocok untuk diperbanyak dan diekspresikan.

Ligasi
Tahap penyambungan molekul DNA yg akan diklon dgn molekul vektor shg menghasilkan DNA rekombinan
Menempatkan ujung-ujung lengket pd molekul ujung tumpul.

Transformasi
Pengambilan DNA secara langsung oleh sel, saat ini dipakai utk mentransfer plasmid-plasmid kecil dr satu galur bakteri ke galur yg lain
Mencampurkan DNA dgn sel resipien/inang (sel kompeten) yg telah dibuat rentan thdp msk molekul DNA
Dgn mikroinjeksi.

Memanen produk (down stream)
Protein manusia tetap berada dlm sel bakteri
Kumpulkan sel dan memurnikannya.
Dipisahkan secara: fisik, kimia baik dari bentuk, ukuran, muatan listrik, kelarutan dlm air/cairan lain, reaktifitasnya terhadap bhn kimia lainnya, dsb

Mencari bakteri yang sesuai
Berbagai koloni bakteri ditumbuhkan pada cawan glas berisi nutrien
Semua sel berasal klon satu sel induk
Sepotong kasa steril ditempatkan diatas cawan secara hati2
Beberapa sel melekat pada kain kasa
Kain kasa diangkat dan pindahkan kecawan lain yang bebas bakteri
Sel yang dipindakan akan memperbanyak diri masing-masing mengandung klon yang sama dan pada posisi yang sama.

Identifikasi bakteri yg mengandung molekul DNA rekombinan plasmid/gen manusia
pBR322: ampR, tetR, Bam HI
Media ampisilin: klon yg mengandung plasmid tetap hidup
Media ampisilin & tetrasiklin: sel yg memiliki plasmid rekombinan mati, krn masuknya gen manusia menghancurkan daya protektifnya


Kloning Gen
Molekul rekombinan yang dihasilkan dengan bantuan plasmid dapat disisipkan pada bakteri yang akan bekerja sebagai pabrik protein
Bakteri yang dipilih adalah E. coli, karena plasmid mempunyai kemampuan memasuki bakteri tsb atau dengan bantuan beberapa senyawa kimia
Plasmid juga dapat memasuki salinan dirinya sendiri
Satu kali memasuki tubuh bakteri plasmid dapat menghasilkan berpuluh replikan yang identik
Bakteri juga melakukan pembelahan sel sehingga dalam waktu singkat akan dihasilkan jutaan sel keturunan  KLON
Semua sel satu klon mempunyai susunan genetik yang sama

Teknik umum DNA rekombinan
Kloning
Teknik inti dlm DNA rekombinan adalah kloning molekler yaitu isolasi dan pengembangbiakan fragmen DNA sejenis
Kloning terdiri 2 tahap yaitu
DNA yg diinginkan atau DNA yg dimasukan, digabungkan dgn molekul DNA yg disebut vektor kloning utk membentuk DNA rekombinan atau klon
Molekul DNA rekombinan dimasukan ke dlm sel melalui proses transformasi. Sel inang yg menangkap molekul DNA disebut transforman atau sel yg ditransformasi.
Suatu transforman mengalami banyak siklus pembelahan sel utk mendapatkan koloni sel yg berasal dari sel inang pemula (asli)
Pd setiap siklus pembelahan, DNA rekombinan di dalam sel juga ikut membelah.
Pada saat koloni sudah terbentuk sempurna, molekul DNA rekombian tunggal telah membelah secara sempurna bahkan sampai beberapa kali.

Mutagenesis
Memodifikasi gen pada organisme tersebut dengan mengganti sekuen basa nitrogen pada DNA yang ada untuk diganti dengan basa nitrogen lain sehingga terjadi perubahan sifat pada organisme tersebut, contoh: semula sifatnya tidak tahan hama menjadi tahan hama.

Mutasi tempat yang terarah (site-directed mutagenesis)

Ex: Mengobati penyakit Thalasemia (mutasi gen untuk protein globin).
Seseorang yg mengalami mutasi (menciptakan kodon stop sbgi kodon as. Amino shg pembentukan globulin terhenti sebelum selesai. Dgn bantuan de-mutasi dpt diobati